in ,

Kayıp Katilin İzi: 1918 İspanyol Gribi’nin keşfi ve rekonstrüksiyonu

1918 Pandemisi’nin ölümcül mirası ve gelecekteki pandemik tehditlere karşı hazırlıklı olma çabalarının önemi.

İspanyol Gribi’nin Perde Arkası

1918 Pandemisi’nin 100. yıl dönümü ve 2009 Pandemisi’nin 10. yıl dönümü, 1918 İspanyol Gribi virüsü’nün keşfine, DNA dizilemesine ve rekonstrüksiyonuna sebep olan, ezber bozan çalışmaları dile getirmek için olanak sağlayan birer dönüm noktalarıdır. Bu işbirliğine dayalı çaba, modern tarihin en ölümcül grip salgınını daha iyi anladı ve küresel halk sağlığı topluluğunun, 2009 H1N1 gibi modern pandemilere ve gelecekteki pandemik tehditlere hazırlanmasına yardımcı olmuştur.

Kimi zaman “İspanyol gribi” olarak da adlandırılan 1918 H1N1 grip salgını, Dünya çapında tahmini 50 milyon kişiyi öldürdü. 1918 Pandemisi’nin alışılmadık bir özelliği, 15 ila 34 yaş arası sağlıklı yetişkinlerde neden olduğu yüksek ölüm oranıdır. 1918 Pandemisi’nin öncesinde ya da sonrasında, bilinen hiçbir mevsimsel grip ya da pandemide böylesine yüksek bir ölüm oranı gözlemlenmemiştir.

Reklam
Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) tarafından çekilen 1918 İspanyol Gribi’ne neden olan virüsün renklendirilmiş görüntüsü. 1918 İspanyol Gribi, Dünya çapında yaklaşık 50 milyon insanın hayatını elinden alarak, bilinen en ölümcül grip salgınına neden oldu.
Photo Credit: C. Goldsmith – Public Health Image Library (PHIL) #11098

Virüs’ün benzersiz şiddeti, araştırmacıları onlarca yıl boyunca şaşırttı ve “1918 virüsü neden bu kadar ölümcül oldu?”, “Bu virüs nereden geldi?”, “Halk sağlığı topluluğu, gelecekteki pandemilere daha iyi hazırlanmak ve onlara karşı savunmak için 1918 virüsünden ne öğrenebilir?” gibi birkaç sorunun ortaya çıkmasına sebep oldu. Bu sorular, kayıp 1918 virüsünü aramak, genomunu dizilemek, virüsü CDC’de son derece güvenli ve regüle bir laboratuvar ortamında yeniden oluşturmak (rekonstrüksiyon) ve en nihayetinde, gelecekteki pandemilere daha iyi hazırlanmak için bu virüsün gizemini çözmek amacıyla bir grup uzman araştırmacıyı ve “virüs avcısını” harekete geçirdi.

Kayıp katili keşfetmek

O zamanki bulaşıcı patojenlerin anlaşılması ve bulaşıcı patojenler üzerinde çalışmaya yarayan araçlar henüz emekleme döneminde olduğu için, 1918 virüsünün kalıntıları on yıllar boyunca tarihin tozlu sayfalarında mahsur kalmıştır. 1918 salgını sonrasında, nesiller boyunca bilim insanları ve halk sağlığı uzmanları, 1918 virüsünün ölümcüllüğünün epidemiyolojik kanıtları ve küresel nüfus üzerindeki olumsuz etkisini hissetti. Alaska’daki, Brevig Mission isimli Okyanus kenarında bulunan küçük köy, hem bu ölümcül mirasın kanıtı hem de 1918 virüsü’nün nihai keşfi için çok önemli olacaktı.

Günümüzde, Brevig Mission’da 400’den az insan yaşıyor ancak 1918 sonbaharında, çoğunluğu Inuit yerlileri olmak üzere 80 civarı yetişkin yaşamaktaydı. 1918 virüsünün, küçük köye yakındaki bir şehirden köpeklerin çektiği kızaklarla seyahat eden tüccarlar tarafından veya yerel bir postacı tarafından getirildiği hakkında söylentiler mevcut olsa da, virüsün köy nüfusuna etkisi barizdir. 1918 yılı 15 Kasım ve 20 Kasım arasındaki beş günlük periyot boyunca 1918 salgını, 80 yetişkin köylüden 72’sinin canına mal olmuştur.

Reklam
1918 salgını sonrasında, Brevig Mission’da 80 yetişkin köy sakininin 72’si ölümcül salgına yenildikten sonra gömüldü.
Photo Credit: Angie Busch Alston

Daha sonra, yerel yönetimin emriyle, köyün yanındaki bir tepede yalnızca küçük beyaz haçlarla işaretlenmiş bir toplu mezar alanı yaratıldı. Yok olan bir topluluk için kederli bir an… Mezarlık, donmuş toprağın altında 1951 yılına kadar dokunulmadan varlığını sürdürdü. 1951 yılında, 25 yaşındaki İsveçli Johan Hultin, mikrobiyolog ve Iowa Üniversite’sinde doktora öğrencisi, 1918 virüsü hakkında yeni bulguları gün yüzüne çıkartmak ve var olduğu süreç hakkında cevaplar bulmak umuduyla Brevig Mission’a bir keşif gezisi düzenledi. Hultin, donmuş mezarlıkta, hayatlarını kaybeden köylülerin dokularının da donmuş toprak sayesinde korunduğunu düşünerek 1918 virüsünün kendisiyle ilgili bulgulara ulaşabileceğine inanıyordu.

1951 yılından olan bu fotoğraf, Johan Hultin’i (Solda) ve aynı üniversiteden olan diğer meslektaşlarını, Brevig Mission’daki kazı alanında donmuş toprağa gömülü kurbanların cesetlerinden 1918 virüsünü alma girişimleri sırasında çekildi.
Photo Credit: Johan Hultin

1951 yılında Hultin, Brevig Mission’daki köyün ileri gelenlerinden (büyüklerinden) mezarlığı kazmak için izin aldı ve meslektaşlarının birkaçının yardımıyla mezarın üzerinde bir kazı alanı kurdu. Kazı günlerce sürdü, çünkü Hultin donmuş toprağı çözebilmek için kamp ateşleri yakmak zorunda kaldı. Kazmaya başladıktan iki gün sonra Hultin, küçük bir kızın bedenine rastladı -Kızın üstünde mavi bir elbise, saçında ise çok güzel bir kırmızı kurdele yer almaktaydı-. Nihayetinde Hultin, alana gömülmüş olan 4 bedenden akciğer dokusunu başarıyla elde edebildi ancak o zaman dilimindeki lojistik ve teknolojik kısıtlamalar zorlu olacaktı.

On yıllar sonra Hultin, CDC Mikrobiyoloğu Doktor Terrence Tumpey ile yaptığı bir konuşmada, Alaska’dan Iowa Üniversitesi’ne dönüş yolculuğunda DC-3 pervaneli bir uçakla uçtuğu ve yakıt ikmali için yolculuk boyunca birden fazla kez iniş yapmak zorunda kaldığını anlattı. Hultin her inişte, uçaktan inip bir yangın söndürücüdeki karbondioksiti kullanarak akciğer örneklerini yeniden dondurmaya çalışmıştı.

Hultin bu olaydan kaynaklanan gürültü sebebiyle, izleyenlerin ve diğer yolcuların şaşkın bakışlarına maruz kaldı. Iowa’ya döndüğünde, virüsü büyütmek için ciğer dokusunu tavuk yumurtasına enjekte etmeyi denedi ancak bu denemesi sonuç vermedi. Daha sonra hiç de şaşırtıcı olmayan bir şekilde Hultin, 1918 virüsü üzerindeki bu ilk denemeden sonuç alamadı.

1951 yılında Johan Hultin’in laboratuvarda çalışırken bir fotoğrafı. Hultin’in 1918 virüsünü kurtarma hususundaki ilk denemesi başarısızdı. Not: Laboratuvar güvenliği hususunda hocalarımızdan öğrendiğimiz en önemli kural “Do not mouth pipette” dir, bu cümle bize pipetlere asla ağzımızı sürmememiz gerektiğini söyler.
PhotoCredit: Johan Hultin

46 yıl sonra, 1997’ye kadar, Hultin’in 1918 virüsünü takip etmek için başka bir fırsatı olmayacaktı. O yıl Hultin, Science dergisinde Jeffery Taubenberger tarafından yazılan “Initial Genetic Characterization of the 1918 “Spanish” Influenza Virus.” ( 1918“ İspanyol ” İnfluenza Virüsünün Başlangıç Genetik Karakterizasyonu.) başlıklı bir yazıyla karşılaştı. O sırada Dr.Taubenberger, Washington DC’de Silahlı Kuvvetler Patoloji Enstitüsü’nde çalışan genç bir moleküler patologdu.

Reklam

Makalede, Taubenberger ve ekibi, 1918 virüsünün genomunun bir kısmını dizilemek için ilk çalışmalarını anlattı. Genom, inşaat için kullanılan taslaklara benzer bir şekilde, bir organizmasının oluşmasını sağlayan genetik talimatların tam listesiydi. Birçok insan, çift sarmallı ve neredeyse tüm canlıların temel genetik özelliklerini belirleyen DNA kavramına aşinadır. Bununla birlikte, bir influenza virüsünün genomu, DNA yerine tek zincirli RNA’dan oluşur. Taubenberger’in ekibi, 1918 virüsünün RNA’sını, Güney Carolina’nın Fort Jackson şehrinde bulunan 21 yaşındaki ABD’li bir askerden elde edilen akciğer dokusundan başarıyla çıkardı. Asker, 20 Ekim 1918’de grip enfeksiyonu ve zatürre teşhisiyle kamp hastanesine getirildi. 6 gün sonra 26 Ekim 1918’de hayatını kaybetti ve bu ciğer dokusu örneği daha sonra çalışılmak üzere muhafaza edildi.

Taubenberger’in ekibi bu dokudan, virüsün sekiz gen segmentinin dördünden dokuz viral RNA fragmanı dizileyebildi. Bu çalışma, 1918 virüsünün genomunun tam dizisi değildi ancak pandemik virüsün o zamana kadarki en net görüntüsünü ortaya koydu. 1918 virüsünün Taubenberger tarafından 1997’de dizilediği bilgileri temel alarak, Taubenberger ve araştırmacıları başlangıçta 1918 virüsünün, kuşların aksine insanlardan ve domuzlardan gelen bir virüs alt grubuna ait yeni bir influenza A (H1N1) virüsü olduğunu iddia etti fakat hala virüs hakkında öğrenilecek çok şey vardı.

Dr. Jeffrey Taubenberger ve Dr. Ann Reid’in, İspanyol Gribi’ne sebep olan virüsün DNA dizilemesini incelerken yakalanmış bir kare. Bu araştırmacılar, virüsün genomunu dizilemekle yükümlüydü.
Photo Credit: National Museum of Health and Medicine Online Exhibit – MIS 377212.

Taubenberger’in makalesini okuduktan sonra Hultin, bir kez daha 1918 virüsünü kurtarmak için ilham buldu. Hultin, Taubenberger’e, Brevig Mission’a geri dönüp dönemeyeceğini ve Alaska’da donmuş topraklara gömülü 1918 virüsünün kurbanlarından akciğer dokuları alıp alamayacağını soran bir mektup yazdı. Daha sonra, bir telefon konuşması sırasında Taubenberger, evet yanıtını verdi. Bir hafta sonra, Hultin, görev için yetersiz araçlarla bir kez daha yola çıktı. Kazıya yardımcı olması için karısının bahçe makasını ödünç aldı.

Hultin’in mezarlığa ilk yolculuğundan bu yana kırk altı yıl geçmişti ve şimdi 72 yaşındaydı. Mezarlıkta tekrardan kazı yapabilmek için köy konseyinden izin istedi ve çalışmalarına yardımcı olması için yerli halktan insanları işe aldı. Hultin’in bu yolculuğunun maliyeti ona 3,200 $ oldu. Bu yolculuk herhangi biri tarafından finanse edilmediği için Hultin bu parayı cebinden ödemek durumunda kaldı. Kazı yaklaşık 5 gün sürdü, ancak Hultin bu sefer kayda değer bir bulgu buldu.

Johan Hultin’in 1918 pandemik grip virüsünü ilk defa kurtarmaya çalışmasının 46 yıl sonrasında, Brevig Mission’daki kazı alanında bir fotoğrafı. (1997) Hultin, daha önce alanı kaplayan küçük haçların kayıp olduğunu gördü, bu yüzden, mezar yerini işaretlemek için yerel bir okulun orman atölyesinde iki büyük haç (yukarıda gösterilmiştir) inşa etti.
Photo Credit: Johan Hultin

Yerin 2 metre altında gömülü ve donmuş toprak tarafından korunan Hultin’in “Lucy” olarak adlandırdığı bir Inuit kadını. Lucy, muhtemelen 20’lerinin ortasında 1918 virüsü sebebiyle ölen obez bir kadındı. Ciğerleri donuk haldeydi ve Alaska toprakları tarafından mükemmel bir şekilde korunmuştu. Hultin onları çıkardıktan sonra koruyucu bir sıvının içine koydu ve ayrı şekilde Silahlı Kuvvetler Patoloji Enstitüsü’nden Doktor Ann Reid’in de dahil olduğu Taubenberger ve ekibine gönderdi. On gün sonra, Hultin belki de herkesin şaşkınlığına sebep olan o telefon konuşmasını yaptı; 1918 virüsünün genetik materyali gerçekten de Lucy’nin ciğerinden elde edilmişti.

1997 yılında, Brevig Mission’daki kazı alanına ikinci yolculuğu sırasında Johan Hultin (72).
Photo Credit: Johan Hultin
Johan Hultin’in Brevig Mission’daki kazı alanından bir cesedi incelerken çekilmiş bir fotoğrafı. Hultin’in kazıyı yönetmek için karısından ödünç aldığı bahçe makası, fotoğrafın ortasında gösterilmektedir.
Photo Credit: Johan Hultin

Genomun İnşaası

Bu bulgunun ilk etkisi öncelikli olarak PNAS dergisinde Ann Reid ve ekibi tarafından 1918 “İspanyol” influenza virüsünün hemaglutinin geninin kökeni ve evrimi (Eng: Origin and evolution of the 1918 “Spanish” influenza virus hemagglutinin gene) olarak adlandırılan yazıda açıklanacaktı. Hultin ortak yazar olarak kabul edilmişti. Makalede, yazarlar (Araştırmacılar) 1918 virüsünün hemaglutinin “HA” genini dizileme (yani karakterize etme) çabalarını anlattılar.

Bir influenza virüsünün HA geni, virüsün HA yüzey proteinlerinin özelliklerini belirler. Bu HA yüzey proteinleri, virüsün, sağlıklı bir solunum yolu hücresine girmesine ve onu enfekte etmesine olarak sağlar. HA, ayrıca bağışıklık sistemi tarafından enfeksiyonla savaşmak için üretilen antikorlar tarafından hedeflenir. Günümüzdeki influenza aşıları, bir influenza virüsünün benzersiz HA’sını hedefleyerek çalışır.

Bir Influenza virüsü. Hemagglutinin (HA), bir grip virüsünün sağlıklı bir hücreye girmesine ve enfekte olmasına sebebiyet veren bir yüzey proteinidir.
Photo Credit: Dan Higgins, CDC

1999’daki makalede, yazarlar, 1918 virüsünün tam uzunluktaki bir HA gen dizisini dizilemeyi başardılar. Bunu başarmak için, makalede daha önce bahsedilen 21 yaşındaki Fort Jackson askeri üssünden bir askerin vücudundan, Brevig Mission’daki Lucy’den ve Camp Upton, New York’ta konuşlanmış 30 yaşındaki bir askerden alınan virüsün RNA fragmanını kullandılar. New York’taki bir asker, 20 Eylül 1918’de influenza dolayısıyla kamp hastanesine kabul edildi, hastalığı hızlı seyretti ve 26 Eylül 1918’de akut solunum yetmezliğinden öldü.

Dizileme bulguları, 1918 virüsünün atalarının 1900-1915 yılları arasında insanları enfekte ettiğini gösterdi. Doktor Reid ve Taubenberger 1918 HA geninin, kuşsal adaptasyonların aksine bir dizi memeli adaptasyonlarına sahip olduğunu ve analiz yöntemine bağlı olarak daha insancıl veya domuzcul olduğunu belirtti. Influenza virüslerini, evrimsel gelişimlerine ve çeşitliliklerine göre gruplandırmak için kullanılan filogenetik analiz, 1918 virüsünün HA’sını memeli kladının temeline yerleştirdi. Bu, muhtemelen bir ata olduğunu veya memelileri enfekte ettiği bilinen en eski grip virüsleriyle yakından ilişkili olduğu anlamına gelir. Bununla birlikte yazarlar virüsün, HA’sını kuşsal virüslerden elde ettiğine inanıyorlardı, ancak virüsün pandemik formda ortaya çıkmadan önce bir memeli konakta ne kadar süre adapte olabileceğinden emin değillerdi.

Mikrobiyolog Dr Peter Palese ve ekibi, Dr Terrence Tumpey tarafından 1918 pandemik virüsünün yeniden inşası için kullanılan plazmidleri oluşturdular. Palese, influenza A, B ve C virüslerinin ilk genetik haritalarının oluşturulması ve mevcut grip antiviral ilaçlarının çoğunluğu tarafından kullanılan mekanizmanın tanımlanması dahil olmak üzere birçok başarıya sahiptir.
Photo Credit: Wikipedia (https://en.wikipedia.org/wiki/Peter_Palese)

Yazarlara göre, 1918 virüs dizilerinin en yakından ilişkili olduğu suş, en eski klasik domuz gribi suşu olan “A / sw / Iowa / 30” dur. Yazarlar, yeni domuz influenza suşunun, 1918 virüsünden çok daha farklı olduğunu ve ne yazık ki 1918 virüsü zamanlarından kalma daha yaşlı domuz gribi suşlarının üzerinde çalışmanın mümkün olmadığını belirtti. Yazarlar aynı zamanda 1918 virüsü HA1 geninin, antijenik kayma süreci boyunca beş ek glikozilasyon bölgesi biriktiren modern insan HA’larından farklı olmak üzere, yalnızca dört glikozilasyon bölgesi olduğunu belirttiler. Antijenik kayma, influenza virüslerinin sürekli kendilerini kopyalamasıyla oluşan gendeki küçük değişikliklere denir. Antijenik kayma, her yıl “grip mevsiminin” olmasının bir nedeni ve aynı zamanda insanların yaşamları boyunca birçok kez grip olmalarının bir nedenidir.

Glikozilasyon bölgelerinin, influenza virüslerinin işlevi için gerekli olduğuna inanılmaktadır ve ilave glikozilasyon bölgelerinin dahil edilmesinin, virüsün insan konaklarına adaptasyonu olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, yazarlar 1918 virüsünün HA’sında istisnai virülansını açıklayacak herhangi bir genetik değişiklik görmemişlerdir.

Modern virülan kuş griplerinin yani influenza A (H5) ve (H7) gibi öldürücü kuş griplerinin aksine, 1918 virüsünün HA geni, bir hastalığın şiddeti veya zararlılığı için genetik imza olarak kabul edilen bir virülansa yani bölünme bölgesi mutasyonuna (Eng: Cleavage site) sahip değildi. HA bölünme bölgesine, amino asitlerin eklenmesi (insersiyon), bir influenza virüsünün normal konak hücrelerin dışındaki dokularda büyümesine sebep olur. Bu tarz bariz belirteçlerin yokluğunda Dr. Reid ve ekibindeki araştırmacılar, 1918 virüsünün şiddetinin arkasında birden fazla genetik faktörün rol oynadığı kanısına vardılar.

Haziran 2000’de “1918 “İspanyol” İnfluenza Virüs Nöraminidaz Geninin Karakterizasyonu” olarak isimlendirilen, 1918 virüsünün nöraminidaz (NA) geninin dizilimini tarif eden ikinci bir makale yayınlanmıştır. Bir influenza virüsünde nöraminidaz geni, virüsün NA geni yüzey proteinlerini kodlamaktan sorumludur (referans için önceki virüs resmine bakınız). Bir influenza virüsü NA yüzey proteinleri, virüsün enfekte hücreden çıkıp diğer hücreleri enfekte etmesine olanak sağlar. Yazar, NA geninin aynı zamanda bağışıklık sistemi tarafından hedef alındığını ve antikorların NA geninin hücreleri enfekte etmesini engelleyemediğini ancak virüsün yayılma hızını önemli ölçüde azalttıklarını belirtmiştir.

Dikkat çekici bir şekilde yazarlar, Lucy’nin vücudundan alınan virüs örneğinden 1918 influenzasının NA geninin tamamını sıralayabildiler. Böylece Hultin’in çalışmasının paha biçilemez olduğu kanıtlandı. Yazarlar, 1918 influenzasının NA geninin hem memeli hem de kuş gribi türleriyle bir çok dizisel ve yapısal karakteristik benzerlikler paylaştığını keşfettiler. Filogenetik analiz, 1918 virüsünün NA geninin, memeliler ve kuşlar arasında bulunduğunu ve genin 1918 pandemisinden kısa bir süre önce memelilerle birleştiğini ileri sürmektedir. Dahası, 1918 virüsünün Lucy’den alınan NA geninin sonraki domuz ve insan izolatlarının, atalarına çok benzediği ileri sürüldü.

Genel olarak, filogenetik analiz, 1918 virüsünün NA’sının nihai kökeninin kuş olduğunu gösterdi ancak araştırmacılar virüsün kuş kökeninden, nihai pandemi formuna giden yolu belirleyemediler. NA’nın genetik özelliklerinin 1918 virüsünün şiddetini açıklayabileceği hususunda araştırmacılar, bir kez daha 1918 virüsünün NA geninin virüsün virülansına katkıda bulunmuş olabilecek tek bir özellik bile bulamadılar. Örneğin, bazı modern grip virüslerinde, amino asit 146’da (WSN / 33’te) NA’da bir glikozilasyon bölgesinin kaybı, virülansa katkıda bulunur ve ayrıca farelerde, virüsün sinir sistemine saldırmasına neden olur. Ancak bu değişiklik, 1918 virüsünün NA’sında bulunamamıştır.

Bu çalışmanın ardından, her biri 1918 virüsünün kalan genlerinin (grip virüslerinin toplamda 8 geni vardır) bulgularını detaylandıran bir dizi ek çalışma yayınlandı. 2001’de, PNAS dergisinde yayınlanan bir makalede Christopher Basler ve ekibi 1918 virüsünün yapısal olmayan geninin dizilenmesini anlattı. 2002’de Viroloji Dergisi’nde (Journal of Virology) Ann Raid ve ekibi tarafından yayınlanan bir makalede virüsün matriks geninin dizilenmesi anlatıldı. 2 yıl sonra, 2004’te Viroloji Dergisi’nde (Journal Of Virology) 1918 virüsünün nükleoprotein (NP) geninin dizilenmesi anlatıldı. 2005 yılında virüsün polimeraz genleri Taubenberger ve araştırmacıları tarafından dizilendi ve bir Nature makalesinde açıklandı. Bu son çalışma, 1918 virüsünün genomunun dizilenmesi üzerine yoğun bir çalışma ile neredeyse 10 yıllık bir süreçte tamamlandı.

1918 virüsünün bütün genomu dizilendiğinden, virüsün canlı bir versiyonunu oluşturmak için gerekli bilgiler mevcuttu. Bununla birlikte, 1918 virüsünün 8 genetik segmentinin her birisi için plazmitler yaratılmasına olanak sağlayacak olan tersine genetik (Eng: Reverse Genetics) işleminin başlaması için ara bir adım daha gerekliydi.

Bu görev, New York Mount Sinai Tıp Okulu’ndan ünlü mikrobiyolog Dr. Peter Palese ve Dr. Adolgo Garcia-Sastre tarafından üstlenildi. Bir plazmid, laboratuvarda çoğaltılabilen (veya kopyanalabilen) küçük dairesel bir DNA ipliğidir. Yıllar önce Dr.Palese, “canlı” influenza virüsleri üretmek için tersine genetikte plazmidlerin kullanımına öncülük etti. Geliştirdiği teknikler, viral genlerin yapısı ve işlevi arasındaki ilişkilerin incelenmesini sağladı ve bu çabalar, 1918 virüsünü yeniden oluşturmak için kullanılan tekniklerin yolunu açtı. Dr. Palese ve Mount Sinai’deki iş arkadaşları plazmidlerin yapımını tamamladıktan sonra onları resmi rekonstrüksiyon sürecinin başlaması için CDC’ye gönderdiler.

Yeniden Oluşturma

20. yüzyılın en ölümcül pandemik grip virüsünü yeniden oluşturma (rekonstrüksüyon) kararı, güvenliğe büyük bir özen ve dikkat gösterilerek verildi. Üst düzey hükümet yetkilileri, yeniden yapılanmanın yeri olarak Atlanta’daki CDC genel merkezinde karar kıldılar. CDC, laboratuvarda çalışmaya başlamadan önce ilk olarak CDC’nin Kurumsal Biyogüvenlik Komitesinden ve ikinci olarak CDC’nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesinden olmak üzere iki aşamalı bir onay aldı. Çalışma, en katı biyogüvenlik önlemleri ve kurallarını kullanan, Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlar olarak da bilinen iyileştirilmiş tesislerde yapılacaktı.

Detaylandırmak gerekirse, araştırmanın ortaya koyduğu risk derecesine karşılık gelen en düşük 1 en yüksek 4 olmak üzere dört biyogüvenlik seviyesi vardır. Her biyogüvenlik seviyesi aynı zamanda spesifik laboratuvar uygulamalarına ve tekniklerine, personel eğitim gereksinimlerine, laboratuvar ekipmanına ve gerçekleştirilen operasyonlara uygun laboratuvar tesislerine karşılık gelir. Bu hususların – yine en düşük 1 en yüksek 4 olmak üzere – değişen sıkılığı; işi, çevreyi ve toplumu gerçekleştiren personeli korumak için tasarlanmıştır.

Her bir biyogüvenlik seviyesi birincil ve ikincil bariyerler olarak bilinen hususlar içermektedir. Birincil bariyerlere örnek olarak güvenlik kabinleri, izolasyon bölmeleri, eldivenler ve önlükler sayılabilir, ikincil bariyerler ise tesisin inşası ve laboratuvardaki havanın HEPA seviyesinde filtrelenmesi gibi hususları içerir. Her bir biyogüvenlik seviyesi için özel kriterler, CDC / NIH yayını Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarlarda biyogüvenlik bölümünde detaylandırılmıştır.

İyileştirilmiş bir Biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarı (BSL-3) ilk ve ikinci seviye bariyerlerin yanı sıra, diğer belirleyiciler de içerir. Örneğin, tüm personel elektrikli bir hava temizleme respiratörü (solunum cihazı) (PAPR), iki kat eldiven, cerrahi takım, galoş ve cerrahi önlük giymelidir. Ayrıca laboratuvardan çıkmadan önce duş almalıdırlar. Ek olarak, virüs veya hayvanlarla yapılan tüm çalışmalar, sertifikalı bir Sınıf II biyogüvenlik kabini (BSC) içinde yapılmalıdır ve laboratuvardaki hava akışı, (yanlışlıkla) laboratuvardan çıkamayacak şekilde yönlendirilir ve filtrelenir.

BSL-3 gelişmiş laboratuvar koşullarında çalışan Dr. Terrence Tumpey’in bir fotoğrafı. Bu fotoğraf, (ancak yalnızca bunlarla sınırlı değildir) elektrikli hava temizleme respiratörü(PAPR), iki kat eldiven, elbise ve ikinci seviye biyogüvenlik kabinini (BSC) göstermektedir. Bugün Dr. Tumpey, CDC’nin Grip Bölümünde İmmünoloji ve Patogenez Şube’sinin şube şefidir.
Photo Credit: James Gathany – Public Health Image Library #7989.

1918 virüsünün yeniden inşaası sırasında yapılacak deneyleri yönetmek için ek önlemler alındı. Örneğin, karışıklıklar ve çapraz kontaminasyonu engellemek için 1918 virüsü üzerinde yapılan çalışmalar, diğer grip virüsleri ile ilgili çalışmalardan ayrı olarak gerçekleştirildi.

Dr. Tumpey, vaktiyle ABD Tarım Bakanlığı adına Georgia, Athens’deki Güneydoğu kümes hayvanları araştırma laboratuvarında mikrobiyolog olarak çalışmaktaydı. Kariyerinin başlarında, yakın zamanda CDC’nin Influenza bölümü direktörlüğünden emekli olan CDC mikrobiyoloğu ve grip uzmanı Jacqueline Katz ile Amerikan Mikrobiyoloji Derneği’ne üyelik başvurusunda bulundu. CDC’nin Influenza bölümündeki iki yıllık üyeliği Dr. Tumpey’in CDC’deki kariyerinin başlangıcı olacaktı. Dr. Tumpey, 1918 pandemik virüsü de dahil olmak üzere influenza virüslerinin, insan sağlığı üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla resmi olarak CDC’ye tayin edildi.

Güvenlik ve emniyet önlemlerinin bir parçası olarak, CDC’nin Direktörlük Ofisi sadece bir kişiye, laboratuvar erişimi izni ve 1918 virüsünün yeniden oluşturulmasının muazzam sorumluluğunun verilmesi hususunda karar kıldı. Bu kişi, o zamanlar CDC Direktörü, Dr. Julie Gerberding tarafından proje için seçilmiş eğitimli mikrobiyolog Dr. Terrence Tumpey’di. 1918 virüsünün yeniden inşaası projesi aynı zamanda projeyi kısmen finanse eden NIH (National Institutes of Health) bünyesindeki NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Disease) tarafından onaylanmıştı.

Dr. Tumpey’in 1918 virüsünün inşaasını tamamlama görevi 2005 yazında başladı. Çevresine ve iş arkadaşlarına karşı oluşturduğu riski en aza indirgemek için, virüsle diğer iş arkadaşlarının günü bitirip laboratuvardan ayrılmasının ardından yalnız başına çalışması gerekti. BSL-3E laboratuvarına erişim için, bir biyometrik parmak izi okuyucusu gerekliydi ve virüsü depoladıkları donduruculara erişim yalnızca Dr. Tumpey’in iris analizi ile mümkündü. Dr. Tumpey, ek bir önlem olarak, kendisinin enfekte olması riskine karşın, bir influenza antivirali olan oseltamivir adındaki bir reçeteli koruyucu ilaçtan günlük doz alıyordu. Eğer enfekte olursa tecrite alınacağı ve dış dünya ile ilişiğinin kesileceği bilgisi kendisine verilmişti. Dr. Tumpey, anlayışla karşıladı ve olası sonuçları göz önünde bulundurarak bu sorumluluğu kabul etti.

Tersine genetik kullanarak, Dr. Tumpey, Dr. Palese tarafından 1918 virüsünün sekiz gen segmentinin her biri için oluşturulan plazmidleri aldı ve bunları insan böbrek hücrelerine yerleştirdi. Plazmidler, daha sonra hücrelere komple 1918 virüsünün RNA’sını yeniden oluşturma talimatını verdi. Temmuz 2005’te birkaç hafta boyunca meslektaşları ve iş arkadaşları Dr. Tumpey’e 1918 virüsünün henüz hücre kültüründe ortaya çıkıp çıkmadığını ve onun 1918 virüsü olup olmadığını sordular.

Dr. Tumpey, 1918 virüsünün hücre kültüründe ortaya çıktığı gün, yok olmuş bir virüsün adeta tarihin tozlu raflarından çıkarılıp tekrar hayata döndüğünü biliyordu. O gün meslektaşlarına ve iş arkadaşlarına, eğlenceli ve Neil Armstrong’dan ilham alan bir e-posta gönderdi (Dr. Tumpey’in ne yazdığı çok tahmin edilebilir ancak burayı keyifle yazdığımı belirtmek istiyorum.). E-posta’da “Bu benim için küçük ama insanlık için büyük bir adım.” yazmaktaydı. Tek bir cümleyle herkes, Dr. Tumpey’in neyi başardığını anlamıştı. Böylelikle Dr. Tumpey, 1918 virüsünün tamamını yeniden inşa eden ilk kişi olmuştu. Bir sonraki adım, onu incelemek ve ölümcül sırlarının kilidini açmaktı.

Yeniden oluşturulmuş 1918 virüsü üzerindeki laboratuvar çalışmaları, Ağustos 2005’te başladı. 7 Ekim 2005’te Science dergisinde (Yeniden İnşa Edilmiş 1918 Influenza Pandemik Virüsünün Karakterizasyonu) başlıklı bir makale yayınlandı. 1918 virüsünün patojenitesini (virüsün hastalığa sebep verme ve konağına zarar verme yeteneği) değerlendirmek için fareleri içeren hayvan deneyleri başlatıldı. 1918 virüsüyle enfekte edilmiş ve hastalıklılık belirtileri gösteren fareler toplandı ve belgelendi. Karşılaştırma için, diğer fareler tersine genetik yoluyla mevsimsel grip, Influenza A (H1N1) virüsleri ve 1918 virüsü arasında çeşitli kombinasyonlar oluşturularak üretilmiş farklı influenza virüsleri ile enfekte edildiler. Bu virüslere, “rekombinant” virüsler denir.

Tamamen yeniden oluşturulmuş 1918 virüsü, hızlı bir şekilde çoğalma, yani kendi kopyalarını oluşturma ve enfekte olmuş farelerin ciğerlerinde enfeksiyonu yayma yeteneği açısından çok dikkat çekiciydi. Örnek vermek gerekirse, enfekte oluşundan 4 gün sonra enfekte farenin akciğer dokusunda bulunan virüs, karşılaştırılan rekombinant grip virüslerinden 39.000 kat daha fazlaydı.

1918 virüsü, son derece öldürücüydü. Şekil a) bir insan mevsimsel H1N1 grip virüsü ile enfekte olmuş fare akciğer dokusunu göstermektedir. Şekil c) 1918 virüsünün, farenin akciğer dokusundaki etkisini göstermektedir. 1918 virüsü hızla çoğalır ve farelerin akciğer dokularında ciddi hastalığa neden olur. 1918 virüsü ile enfekte olmuş insanların akciğerlerinde de ciddi hastalıklara neden olmuştur.
Photo Credit: CDC, Science.

Dahası, 1918 virüsü farelerde çok ölümcüldü. Bazı fareler enfekte olduktan üç gün sonra öldü ve enfekte oluşlarının ikinci gününe kadar vücut ağırlıklarının %13’ünü kaybettiler. 1918 virüsü, test edilen diğer rekombinant virüslerden en az 100 kat daha ölümcüldü. Deneyler, 1918 virüsünün HA geninin virüsün şiddetinde büyük bir rol oynadığını gösterdi. 1918 virüsünün HA geni aynı zamanda A/Texas/36/91 veya kısaltma olarak Tx/91 olarak da bilinen influenza A(H1N1) virüsü ile değiştirildiğinde ve kalan 7 gen ile birleştirildiğinde, ortaya çıkan rekombine virüs özellikle enfekte olmuş fareleri öldürmedi ve önemli kilo kaybına neden olmadı.

Soldaki fotoğraf, hücre kültüründe Tx / 91 adı verilen bir insan mevsimsel grip virüsünün replikasyonunu (çoğalmasını) göstermektedir. Sağdaki fotoğraf ise aynı virüsün polimeraz (PB1) geninin, 1918 virüsü ile değiştirildiği zaman, ortaya çıkan virüsün çoğalma yeteneğinin nasıl büyük ölçüde arttığını göstermektedir.
Photo Credit: Terrence Tumpey, CDC.

1918 virüsünün sebep olduğu enfeksiyonun farelerin beyin, kalp, karaciğer ve dalak gibi diğer hayati organlarına yayılıp yayılmadığını belirlemek için başka deneyler yapıldı. Laboratuvar testleri bu organlarda virüsü tespit etmedi, bu da 1918 virüsünün, kurbanlarında sistemik enfeksiyona neden olmadığını gösterdi.

Bununla birlikte, 1918 virüsünün kanıtlanmış bir etkisi hızlı ve ciddi akciğer hasarıdır. 1918’de, pandemik virüsün kurbanları sıvı dolu akciğerlerin yanı sıra şiddetli pnömoni (zatürre) ve akciğer dokusu iltihabı yaşadı. Enfeksiyondan sonraki dört gün içinde, 1918 virüsü ile enfekte olan fareler benzer akciğer komplikasyonları yaşadı ve bunun 1918 virüsünün şiddetinin benzersiz bir yönü olduğunu ortaya koydu.

1918 virüsünün akciğer dokusu üzerindeki etkisi, Calu-3 hücreleri olarak bilinen bir insan akciğer hücre hattı kullanılarak da araştırıldı. Hücrelerdeki 1918 grip virüsü miktarı, enfeksiyondan 12, 16 ve 24 saat sonra ölçüldü ve bu sonuçlar, insan mevsimsel grip virüslerindeki genlerle karıştırılmış 1918 virüsü genlerinin bir kombinasyonu ile rekombinant virüsler tarafından üretilenlerle karşılaştırıldı. Farelerde alınan sonuçlara benzer şekilde, 1918 virüsü hızlı şekilde çoğaldı ve insan akciğer hücrelerine yayıldı. Şöyle ki 1918 virüsü, karşılaştırılan virüslerden birinin 50 katından daha fazla üredi. Bu deneyler, HA genine ek olarak, 1918 virüsünün polimeraz genlerinin, virüsün insan akciğer dokusundaki enfektivitesi ve virülansında önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur.

1918 virüsünün olası kuş kökenini daha iyi anlamak için başka bir dizi deney daha yapıldı. Dr. Taubenberger ve Reid tarafından yönetilen daha önceki dizileme uğraşları, 1918 virüsünün gen segmentlerinin, diğer memelilerde bulunan H1N1 virüslerinden çok, kuş gribi A (H1N1) virüsleriyle daha yakından ilişkili olduğunu ileri sürmüştü. Araştırmacılar, 1918 virüsünün döllenmiş tavuk yumurtalarına, yani bir embriyo içeren tavuk yumurtaları üzerinde yüksek derecede patojenik kuş gribi virüslerine benzer şekilde ölümcül olup olmayacağını bilmek istiyorlardı.

Bir cevap bulmak için, 10 günlük döllenmiş tavuk yumurtalarına 1918 virüsü aşılandı. 1918 virüsü, yeni H1N1 kuş gribi virüsünün sebep olduğu etkilere benzer olarak tavuk yumurtası embriyoları için ölümcül olduğunu kanıtladı. Özellikle, insan mevsimsel influenza A (H1N1) virüslerini kullanan karşılaştırma deneylerinin tavuk embriyoları üzerinde aynı yıkıcı etkiye sahip olmadığı görülmüştür. Dahası, Dr. Tumpey’in oluşturduğu 1918 virüsünden 2, 5 veya 7 gen içeren birleştirilmiş grip virüsleri de tavuk embriyolarına zarar vermedi. Fare ve insan akciğer hücreleri üzerinde yürütülen çalışmalardaki gibi, döllenmiş tavuk yumurtaları üzerinde yapılan deneyde de 1918 virüsünün HA ve polimeraz genleri virülansında muhtemel rollere sahipti.

Dr. Tumpey ve CDC’deki iş arkadaşları tarafından yürütülen çalışma 1918 virüsünün virülansına katkıda bulunan yeni özellikler hakkında bilgi sağladı. Dr. Tumpey HA ve PB1 virüs genlerinin virüsün şiddeti ve bulaşıcılığına binaen önemli rolleri olduğunu belirtti. Bununla birlikte, 1918 virüsünün genlerinin tümü olmasa da bir kısmı ile grip virüslerini içeren deneylerinin gösterdiği gibi, 1918 virüsünü son derece tehlikeli yapan şey tek bir bileşeni değil, 8 geninin oluşturduğu eşsiz kombinasyon idi.

1. Dünya savaşı sırasındaki askeri kuvvetlerin hareketliliğinin ve sıkışık koşulların, 1918 virüsü’nün Dünya’ya yayılmasında etkisi olduğu düşünülmektedir.
Photo Credit: Syndicate, Museum – 56784#
Reklam

Tumpey ve meslektaşları, “8 genin bir araya gelince oluşturduğu küme, son derece öldürücü bir virüs yaratıyor.” dedi. Test edilen başka hiçbir insan grip virüsü olağanüstü derecede virülan değildi. 1918 virüsü özeldi – doğanın, evrimin, insanların ve hayvanların birbirine karışımının eşsiz ölümcül ürünü. 1918 virüsü, doğanın değişen halk sağlığı endişesi ve kökenine ilişkin gelecekteki pandemileri üretme yeteneğinin bir parçası olarak hizmet edecektir.

Kaynaklar ve İleri Okuma: